d88尊龙凯时“检测直通车”之食品及水样中诺如病毒的检测|真钱二八杠|

2025-02-19 06:49:18

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　　诺如病毒(Norovirus)是一组杯状病毒属病毒◈✿，其原型株诺瓦克病毒(Norwalk-like viruses)于1968年在美国诺瓦克市被分离发现◈✿。诺如病毒感染性强◈✿，以肠道传播为主◈✿，可通过污染的水源◈✿、食物◈✿、物品◈✿、空气等传播◈✿，常在社区◈✿、学校◈✿、餐馆◈✿、医院◈✿、托儿所◈✿、孤老院及军队等处引起集体暴发◈✿。感染者发病突然◈✿，主要症状为恶心◈✿、呕吐◈✿、发热◈✿、腹痛和腹泻◈✿。

　　世界上很多地区都有暴发的案例◈✿，例如2010年广州从化因为水污染引起的诺如病毒感染事件◈✿，共有429人发病;2012年9月底◈✿，德国首都柏林以及东部三个地区1万多名小学生和托儿所的幼儿发生疑以诺如病毒食物中毒;尤其以2012年12月◈✿，日本各地接连发生一系列因诺如病毒而引起的集体食品中毒事件最此人关注d88尊龙凯时◈✿，从爱知县名古屋市一直到广岛县广岛市总的中毒人数1809人◈✿。

　　诺如病毒是全球流行性与散发性腹泻的主要病原之一◈✿，受污染的食品◈✿、水源是诺如病毒传播的重要污染源◈✿，例如贝类◈✿、水果◈✿、蔬菜◈✿、饮用水◈✿、水源水等◈✿。目前◈✿，我国在食品与水样中诺如病毒检测方面还没建立有相关的国家标准◈✿。根据文献报道d88尊龙凯时◈✿，诺如病毒的检测方法主要包括电镜法◈✿、免疫法及分子扩增法(主要为PCR方法)◈✿，其中分子扩增方法被认为是食品中检测诺如病毒的唯一方法(其他两种方法灵敏度差)d88尊龙凯时◈✿，而PCR则为“金标准”而被广泛作地采用◈✿。因此◈✿，完整的食品与水样中诺如病毒检测的主要流程共包括病毒的提取d88尊龙凯时◈✿、核酸的纯化以及病毒的分子检测◈✿。

　　挑取被检样本或者被检样本中病毒易富集部位(例如贝类的消化腺组织)真钱二八杠◈✿，通过蛋白酶K消化的方法解离病毒◈✿，然后通过异硫氰酸胍等试剂纯化病毒RNA◈✿，接下来继续将病毒RNA进行反转录◈✿，最后将产物cDNA进行PCR检测◈✿。

　　荧光定量PCR仪◈✿、振荡培养箱◈✿、涡旋振荡器◈✿、离心机◈✿，TRIzol试剂◈✿、MMLV反转录试剂盒◈✿、Taqman realtime-PCR试剂盒超均为商品化试剂◈✿，其他试剂为国产分析纯◈✿，实验用水为不含核酸酶的超纯水◈✿。

　　选取被检适当量样本(不同种类食品样本量不同)◈✿。以贝类样本为例◈✿，一般取5~10个左右◈✿，用无菌水冲洗干净贝壳表面后撬开贝壳◈✿，然后用无菌的手术刀切取其中的消化腺组织共1.5g◈✿，并尽量切碎贝类组织◈✿。

　　2.蛋白酶K消化诺如病毒解离的方法有很多◈✿，包括PEG沉淀法◈✿、超滤法◈✿、超速离心法等等◈✿，而蛋白酶K消化的方法由于其自身简单◈✿、耗时短◈✿、稳定性高等特点◈✿，而被欧洲标准化委员会认定为贝类中诺如病毒解离的标准操作方法◈✿。

　　RNA纯化用硅胶膜试剂盒与TRIzol试剂是目前主要采用的病毒RNA的纯化方法◈✿。目前本实验室采用TRIzol试剂法进行诺如病毒RNA的纯化◈✿：

　　①取300μL上清液◈✿，加入到含1mL预冷的Trizol的EP管中◈✿，混匀后室温放置5min◈✿，加入0.2mL氯仿◈✿，充分混匀或旋窝震荡15s真钱二八杠◈✿，室温放置5min◈✿，12000g离心15min;

　　②小心取上层水相600μL至含有预冷的600μL异丙醇的EP管中◈✿，混匀◈✿，室温放置10min◈✿，12000g离心10min;

　　③小心倒掉上清◈✿，加入1ml 75%乙醇(用DEPC处理的水进行配制)d88尊龙凯时◈✿，洗涤沉淀d88尊龙凯时◈✿，12000g离心5min;倒掉上清◈✿，尽量吸净残留液体◈✿，室温放置风干数分钟;

　　④加入50μL无Rnase的H2O溶解RNA◈✿，可选择于70℃水浴5min加速RNA溶解◈✿，然后放于-80℃保存或直接用于反转录操作◈✿。

　　本实验目前采用两步法RT-PCR的方法进行诺如病毒的检测◈✿，因此首先将纯化的RNA进行反转录操作◈✿。采用M-MLV反转录试剂盒进行病毒RNA的反转录◈✿：

　　③按以下程序进行反转录◈✿：30℃预处理10min◈✿，37℃反转录60min◈✿，最后70℃处理15min以灭活反转录酶等◈✿。

　　PCR检测的方法可分为定性检测与定量检测◈✿，而realtime PCR被引入到诺如病毒检测后◈✿，由于其灵敏度高◈✿、检测时间短◈✿、污染风险小等优点而被广泛使用◈✿。本实验室目前采用Taqman realtime-PCR方法进行诺如病毒的定量检测◈✿。

　　广东省微生物分析检测中心是1999年经广东省机构编制委员会批准◈✿，在广东省微生物研究所的基础上成立◈✿，并于当年通过计量认证(CMA)◈✿，现隶属广东省科学院◈✿，在检测业务上接受广东省质量技术监督局领导◈✿。2004年◈✿，中心通过中国实验室国家认可委员会(CNAS)认可◈✿，是具有独立法人地位的第三方实检测验室真钱二八杠◈✿。

　　主要对外业务包括◈✿：食品◈✿、保健品◈✿、饮料及饮用水检测;食品安全性检测与评价;农产品检测;药品◈✿、一次性使用医疗用品检测;化妆品◈✿、日化产品◈✿、卫生用品检测;防霉◈✿、抗菌◈✿、消毒产品及消毒器械的检测;玩具◈✿、电器◈✿、空气净化器◈✿、室内装饰装修材料检测;公共场所用具及包材检测;微生物菌剂的环境安全性测试和评价;水质检测;空气检测;菌种鉴定;微生物控制及检测培训与技术服务等◈✿。

　　检测中心自成立以来◈✿，业务遍及全国◈✿，具有很高的知名度和影响力◈✿。检测中心的科技人员积极跟踪国内外相关行业的国际标准◈✿、国家标准的制定真钱二八杠◈✿、修订的发展情况◈✿，主持和参与了50多项国家标准◈✿、行业标准◈✿、地方标准的制修订工作◈✿。2006年被广东省科技厅批准为 “广东省食品安全检测与评价科技创新平台”食品微生物安全性检测与评价中心◈✿，并成为该平台建设的主要承担单位◈✿。2010年亚运会在广州举办之时◈✿，受邀参与“第十六届亚运会公共卫生保障合作实验室”◈✿，成为广州地区共同承担“亚运期间新发传染病◈✿、食物中毒等重大突发公共卫生事件实验室检验检测工作”的8家实验室之一◈✿。

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